*CBTIS 155*
Tinciones Diferenciales
INTEGRANTES:
Águila Cabrera Oscar Uriel
Esparza Quiroz Brenda Lucila
Flores Hernández Cynthia Giselle
Huerta Álvarez Thania Sarahi
Montes Gutiérrez Kimberley
Ramírez Barragán Brenda Berenice
MATERIA: Procesar Cultivos Bacteriológicos
PROFESOR: Víctor Manuel Alfaro López
MESA: 3
Grupo: 4L2M
Tinciones Diferenciales
Tincion De Gram
Antecedentes de la Tinción de Gram
La Tinción De Gram. Fue desarrollada empíricamente por Christian Gram en 1884, a pesar del tiempo transcurrido la tinción apenas se ha modificado y es uno de los primeros pasos que se realiza para cualquier identificación bacteriana.
La técnica es capaz de diferenciar dos grandes grupos de bacterias Gram Positivas y gram Negativas.
Fundamentos de la tinción de Gram.
Resultados De La Coloración
| Gram Positivas | Gram Negativas |
| Se observan de azul por el cristal violeta. | Se tiñen rosa por la safranila. |
| No perderán la coloración del azul violeta durante los pasos sucesivos. | Perderán la coloración inicial con los siguientes pasos. |
| Poseen una malla de peptidoglucano en su parte externa. | Se teñirán de rosa debido a la Safranina. |
| :) | Una fina capa de peptidoglucano y presentan una membrana externa. |
Reactivos y Colorantes
La tinción de Gram requiere cuatro soluciones:
· P r i m e r c o lo r a n t e: Un colorante básico (+) que en contacto con células cargadas negativamente, reacciona con ellas coloreándolas. El más utilizado es el cristal violeta. (1’)
· S o l u c i ó n M o r d i e n t e: Fija las tinciones y aumenta la afinidad entre el colorante y las células. Los mordientes usados suelen ser sales metálicas acidas bases, como por ejemplo, una solución diluida en yodo. (1’)
· A g e n t e D e c o lo r a n t e: Es un disolvente orgánico, por ejemplo alcohol acetona. (30 seg.)
· C o lo r a n t e D e C o n t r a s t e: Es un colorante básico de distinto color que el primer colorante, como por ejemplo, la Safranina. (1’)
Procedimiento técnico.
• Realizar el extendido de la muestra.
• Fijacion del extendido.
• Métodos físicos: acción del calor
• Métodos químicos: metanol
• Primer colorante: cristal violeta
• Mordiente: Lugol (sc I2/KI)
• Decoloración: mezcla alcohol-acetona 1:1
• Segundo colorante: safranina
Tinción de Ziehl-Neelsen
Variante histológica
· Ácido periódico 5%
- carbol fucsina de Ziehl (fucsina fenicada). Preparar mezclando en el orden dado:
- 0,5 g fucsina básica
- 50 cc agua destilada
- 5 cc etanol absoluto
- 2,5 g cristales de fenol derretidos
- hematoxilina
- alcohol ácido 1%:
- alcohol de 70º
- ácido clorhídrico
Procedimiento:
El procedimiento es el siguiente:
• desparafinar e hidratar los cortes
• ácido periódico 5%, 10 min
• lavar con agua destilada
• fucsina fenicada, 15 min
• decolorar en alcohol ácido al 1%
• lavar con agua destilada
• hematoxilina, 10 min
• azulidificar con, por ejemplo, carbonato de litio
• deshidratar, aclarar y montar preparaciones
Los cortes que se hacen en la piel para la variante histológica del procedimiento de ziehl neelsen solo los realiza los patólogos ya que se dedican al diagnóstico basado en la observación morfológica de lesiones en la piel provocadas por bacterias y hongos su área en la medicina diagnostican a través de los análisis propios del laboratorio clínico, e incluye Hematología analítica, Inmunología diagnóstica, Microbiología diagnóstica, Bioquímica o Química clínica, Citogenética y Genética Molecular. Expertos en entender cómo funciona en vida el cuerpo humano, los patólogos están igualmente bien informados en la descomposición gradual que tiene lugar una vez que la llama se ha extinguido. Realizando estos cortes la única tinción que se puede utilizar con los cortes es la tinción de ziehl neelsen que los reactivos que se utilizan ya que si se quiere investigas si son BAAR.
Variante clásica o "en caliente"
Ésta y la siguiente variantes son para preparaciones citológicas.
- Hacer un frotis de la muestra de esputo.
- Dejar el frotis sobre el puente de tinción.
- Aplicar fucsina-fenicada.
- Calentar con un mechero hasta la emisión de vapores (3-5 minutos).
- Decolorar con alcohol-ácido.
- Aplicar azul de metileno (1 minuto).
- Enjuagar con agua
En "frío"
- Hacer un frotis.
- Dejarlo en el puente de tinción.
- Aplicar fucsina-fenicada (solución con fenol y mayor concentración de fucsina).
- Dejar en vasos coplin durante 20 minutos.
- Decolorar con alcohol acido.
- Lavar con agua del grifo.
- Contrastar con azul de metileno
Algunos microorganismos ácido-alcohol resistentes
• Mycobacterium: fuertemente ácido-alcohol resistentes
• Nocardia y Actinomices: débilmente ácido-alcohol resistentes.
• Parásitos coccídeos (Cryptosporidium) de muestras [fecales].
Mycobacterium:
El género incluye patógenos que causan graves enfermedades en los mamíferos, incluyendo tuberculosis y lepra. El prefijo latino "myco—" significa tanto hongo como cera; su uso aquí se relaciona con los compuestos cerosos de la pared celular. Las micobacterias tienen forma de bacilos rectos o ligeramente curvados y miden 0,2-0,6 µm de ancho por 1,0-10 µm de largo. Las micobacterias son bacterias aerobias y no móviles (con excepción de la especie M. marinum, que ha mostrado ser móvil dentro de los macrófagos). Tienen acido-alcohol resistencia, no producen endosporas ni cápsulas y suelen considerarse Gram-positivas.
Micobacterium Marinum:
Esta mycobacteria solo se encuentra en acuarios, estanques, y aunque es poco frecuente la infección, solo humanos que tengan contacto con este tipo de lugares la adquieren.
Nocardia:
Es un género de bacterias Gram-positivas que se encuentran en suelos de todo el mundo ricos en materia orgánica. Son catalasa-positivas y con forma de bacilos filamentosos, parecen hilos alargados. Algunas especies son patogénicas causando nocardiosis. La mayoría de las infecciones causadas por Nocardia se adquieren por inhalación de la bacteria o a través de traumatismos.
Cryptosporidium:
Es un género de protistas parásitos del filo Apicomplexa al que se asocia con una enfermedad llamada criptosporidiosis diarreica en seres humanos. Otros apicomplejos patógenos incluyen Plasmodium, el parásito de la malaria, y Toxoplasma, el agente causante de la toxoplasmosis. El parásito se contrae por vía fecal-oral. Los ooquistes esporulados, conteniendo cuatro esporozo, son excretados por el huésped infectado a través de las heces y posiblemente otras rutas, tales como las secreciones respiratorias.
Corynebacterium:
Es un género de bacterias, bacilos y gram positivos, inmóviles, anaerobio facultativos, pertenecientes al filo actinobacteria. Es uno de los géneros más numerosos de actinobacterias con más de 50 especies, la mayoría no causa enfermedades, sino que son parte de la flora saprófita de la piel humana.
Fundamento
Este método se basa en que las paredes celulares de ciertos parásitos y bacterias contienen ácidos grasos (por ejemplo, el ácido micólico) de cadena larga (50 a 90 átomos de carbono) que les confieren la propiedad de resistir la decoloración con alcohol-ácido, después de la tinción con colorantes básicos. Por esto se denominan ácido-alcohol resistencia|bacilos ácido-alcohol resistentes o BAAR. Las Mycobacterium|micobacterias como Mycobacterium tuberculosis|M. tuberculosis y Mycobacterium marinum|M. marinum y los parásitos cocoLa coloración clásica de Ziehl-Neelsen requiere calentamiento para que el colorante atraviese la pared bacteriana que contiene ceras.
OTRAS TINCIONES
TINCION DE ESPORAS
Algunas bacterias son capaces de desarrollar formas de resistencia denominadas esporas como mecanismo de defensa a agresiones ambientales. Son estructuras de pared gruesa en las que el microorganismo logra soportar las condiciones desfavorables de calor, desecación, acidez, etc. Cuando las condiciones ambientales vuelven a ser favorables las esporas "germinan" y vuelven a generarse formas vegetativas. Sólo algunas bacterias son capaces de formar esporas y esta característica puede en algunos casos orientar el diagnóstico. Están descritos varios métodos para teñir esporas. Quizás el más utilizado sea el de Wirtz-Conklin o tinción con verde malaquita. Este colorante se une fuertemente a las esporas gracias a la utilización de calor como mordiente. La fase de decoloración en este caso se realiza con agua abundante. Las formas vegetativas pierden el color verde y se tiñen con el colorante de contraste (fucsina o safranina).
TINCION DE VERDE MALAQUITA (Wirtz-Conklin)
El verde de malaquita es un colorante verde activo frente a una gran variedad de parásitos externos y agentes patógenos como hongos, bacterias, etc. Su principal aplicación es para el tratamiento contra parásitos protozoos de agua dulce. Algunos géneros bacterianos, entre los que destacan Clostridium y Bacillus, producen en su interior formas de resistencia denominadas endosporas. Se producen cuando las condiciones ambientales son desfavorables (agotamiento de los nutrientes, temperaturas extremas, radiaciones, compuestos tóxicos, etc.) formándose una espora por cada forma vegetativa.
Tinción negativa de cápsulas
Algunas bacterias presentan una capa externa a la pared denominada cápsula. Está compuesta de azúcares y proteínas. No es una estructura vital para la bacteria, de modo que es posible que bajo determinadas condiciones ambientales o del propio desarrollo genere cápsula y bajo otras no lo haga. Se ha comprobado que la presencia de cápsula dificulta de algún modo la fagocitosis de las bacterias, es decir las cápsulas constituyen un factor de virulencia de los microorganismos.
La detección de cápsulas en las bacterias también puede orientarnos en el diagnóstico de laboratorio, y es especialmente importante en el diagnóstico de meningitis producida por Cryptococcus neoformans.. Se trata de una levadura que provoca graves cuadros de meningitis en personas inmunocomprometidas, y su detección en LCR lo más precozmente posible es vital para la supervivencia del paciente.
Conclusión
Las tinciones diferenciales son importantes y útiles ya que se realiza un proceso de fácil manejo con estas tinciones se observa cómo cambia la coloración de la pared celular de una bacteria pero dependiendo ya que cada bacteria se puede realizar con diferentes tinciones.
Bibliografías
http://www.slideshare.net/josemagarinos/tinciones-diferenciales-aspectos-tecnicos
http://es.wikipedia.org/wiki/Tinci%C3%B3n_de_Gram
http://es.wikipedia.org/wiki/Tinci%C3%B3n_de_Ziehl_Neelsen
